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康春生团队等学者发现胶质瘤替莫唑胺耐药关键

日期:2020-04-07 09:34 人气:

胶质母细胞瘤是最常见的颅内原发性恶性肿瘤,其增殖和侵袭能力强,并且容易术后复发。表皮生长因子受体(EGFR)和它的III型突变体(EGFRvIII)是目前胶质母细胞瘤的重要驱动基因,也是癌症治疗的靶点,其导致的下游因子异常激活是肿瘤患者预后不良的关键因素[1]。

 

虽然目前很多化疗药物,如替莫唑胺(TMZ),亚硝基脲类和顺铂已经显示对胶质母细胞瘤患者的临床获益,但这些药物的治疗效果仍不甚满意,主要因为内在的或获得性的耐药性[2,3]。而替莫唑胺仍是目前唯一的一线抗癌药。

 

基于CRISPR-Cas9基因编辑技术的基因筛选系统使用表达sgRNA的慢病毒文库造成大量蛋白失功能筛选,这种筛选方法具有高灵敏性和特异性,适合鉴定细胞生长依赖的关键基因和筛选介导耐药的重要基因[4,5]。

 

2019年7月24日,天津医科大学总医院康春生团队、首都医科大学天坛医院江涛教授以及天津医科大学吴旭东教授合作在Advanced science上发表题为Genome-Wide CRISPR-Cas9 Screening Identifies NF-κB/E2F6 Responsible for EGFRvIII-Associated Temozolomide Resistance in Glioblastoma的文章,发现了胶质母细胞瘤耐药的关键基因E2F6,并且NF-κB抑制剂JSH-23联合TMZ可以更有效的治疗胶质母细胞瘤,这为胶质瘤的临床治愈提供了新的途径。

 

 

 

研究人员首先用慢病毒的空载体和EGFRvIII感染U87细胞以形成U87NC和U87EGFRvIII细胞系。然后将这些细胞用作体外实验模型。为了鉴定GBM细胞对TMZ耐药的相关基因,应用全基因组CRISPR-Cas9为基础的筛选文库,这种sgRNA慢病毒文库包含123,411 sgRNAs,靶向20,914人类基因,包括19050蛋白编码基因和1864个microRNA表达基因。两种筛选均用DMSO和350μM的 TMZ分别处理0,7和14天。然后通过基因组中sgRNA序列扩增后的高通量测序计算所有剩余细胞中的sgRNA覆盖率。然后对每个基因的sgRNA进行加权,分析这些基因。最终确定了E2F6和EGFRvIII/PI3K/AKT/NF-Κb信号通路与TMZ耐药非常相关。

 

 

研究人员通过数据分析和体内外实验进一步证明了E2F6表达不仅与胶质瘤的WHO分级相关,更是TMZ抗性基因。同时揭示了E2F6受EGFR/PI3K/AKT途径中的H3K4me3和NF-κB调节。然后通过构建人脑胶质瘤来源的小鼠原位胶质瘤模型,揭示了NF-κB抑制剂JSH-23联合TMZ可以达到更好的治疗效果。

 

  

CRISPR-Cas9是近年研究最具热点的基因编程技术。基于CRISPR-Cas9的全基因组筛选文库被多个研究证实是一个有效且简单易行的生物学方法。本研究通过筛选后的sgRNA测序,并与过表达EGFRvIII所得的RNA测序数据进行比对,发现E2F6在EGFRvIII细胞中上调,并且是其中一个替莫唑胺耐药相关基因。首先证明了E2F6是通过EGFRvIII/PI3K/AKT/NF-κB通路调控的,并且,替莫唑胺诱导DNA损伤后的NF-κB磷酸化激活也是增加E2F6表达的重要组成部分。过表达E2F6的细胞明显对替莫唑胺耐药,而敲低E2F6的细胞对替莫唑胺敏感,这些现象也显示E2F6是重要的替莫唑胺耐药相关基因。抑制E2F6可以增加替莫唑胺敏感性,意味着E2F6抑制剂和替莫唑胺联合治疗可以增加对胶质母细胞瘤的治愈性。本研究不仅为胶质瘤的治疗提供了新靶点,更为其他肿瘤的耐药治疗的研究提供了新的方法。